鹦鹉喙羽症的流行病学调查
鹦鹉喙羽症的流行病学调查
  • 异类宠物
  • 2018-07-04 14:03:29
  • 来源: 唐国梁(美联众合动物医院转诊中心)
  • 摘要近年来鹦鹉喙羽症(Psittacine beak and feather disease,PBFD)成为中国鹦鹉高发疾病之一,对幼年鹦鹉的威胁尤为明显。PBFD临床...

    摘要

    近年来鹦鹉喙羽症(Psittacine beak and feather disease,PBFD)成为中国鹦鹉高发疾病之一,对幼年鹦鹉的威胁尤为明显。PBFD临床表型和严重程度呈多样化,包括羽毛异常、呼吸系统疾病、消化系统疾病等。病毒携带个体可能突然死亡,也有可能不表现任何临床症状,所以常规临床诊断存在比较大的难度。本研究对157 个鹦鹉血液样本所提取的DNA进行了巢式PCR扩增,证实分子诊断可以准确灵敏地检测和确诊PBFD病例。实验样本中有怀疑临床症状的病例的阳性检出率为 61.1%(96/157),高于已有文献报道。

    背景

    鹦鹉喙羽症,英文全称是Psittacine beak and feather disease,简称PBFD,于20世纪70年代在澳大利亚的凤头鹦鹉上首次发现[1],是临床中幼年鹦鹉的常见病毒性疾病。这一病毒能够感染包括牡丹鹦鹉、虎皮鹦鹉、玄凤鹦鹉、非洲灰鹦鹉、折衷鹦鹉、吸蜜鹦鹉、亚马逊鹦鹉、凤头鹦鹉、锥尾鹦鹉及金刚鹦鹉等60多种鹦鹉[2,3]。其中临床中非洲灰鹦鹉的感染病例很多,这可能与近年来非洲灰鹦鹉成为广受欢迎的宠物鸟儿而被大量繁殖有关。PBFD的病原是喙羽症病毒(BFDV)[4],属于圆环病毒科[5],是一种非常小的单链环状DNA病毒,病毒颗粒直径为14-17nm[6]。

    这种病毒的传播途径十分广泛,病毒在感染鸟儿数月后便可通过羽粉和粪便向环境释放病毒。鸟儿可能通过呼吸摄入或吃下带毒羽粉或新鲜/干燥的粪便污染的水或食物而感染[1,7,8]。由于这种病毒抗杀灭能力强,可以很容易的通过沾染在人的衣物上,鸟类用具,运输箱,笼子等物品传播给其他个体。母鸟还可以通过蛋将病毒传播给后代[9]。该病毒的主要攻击目标是分裂活跃的细胞,因此其主要影响的是免疫器官、皮肤和羽毛。这会导致免疫抑制以及喙和羽毛的异常生长。

    针对羽毛的影响是其导致上皮细胞发生凋亡或异常增生[10],产生羽毛的异常脱落或生长[11,12]。异常的情况包括:长期保留不打开的羽鞘;羽毛内的血液无法重新吸收;羽毛呈现短棒状、卷曲、畸形或带有大量恶斑[1,4,13,14]。喙部的异常因物种而差异,并不是所有的个体都会表现出喙部异常[6]。同时该病毒对免疫系统存在抑制。临床上绝大部分PBFD病例并不是由于病毒直接导致动物死亡,而是由于免疫功能抑制引起的继发感染导致动物死亡[6,15]。

    PBFD有三种不同的表型,不同表型的出现在很大程度上取决于被感染时鸟的年龄[16]。许多患有PBFD的幼鸟常表现出营养不良,这也会影响病程。特急型大多在刚孵化出的雏鸟中表现。主要表现为白细胞减少、贫血、全血细胞减少、肝坏死等异常[17]。大多数的鸟儿在没有表现出任何临床症状迹象时就可能突然死亡[6,18,19]。急型主要表现在1岁以内的亚成鸟。患鸟常表现出精神沉郁,厌食,虚弱和腹泻。免疫抑制导致的常见并发症可能包括肺炎及肠炎[1,12]。羽毛可能会受到影响,通常表现为羽粉减少,羽毛畸形脱落或羽色变化。慢性主要表现在成年个体,常表现为羽毛缺失和畸形,经常随着换羽的发生而进一步恶化[20]。免疫抑制也会引起继发感染等并发症[1]。随着疾病的发展,喙和指甲可能变得非常脆弱。总的来说感染PBFD的个体死亡率非常高。能够给予的治疗很大程度上是支持性治疗,以帮助患鸟增强机体免疫力来抵抗病毒和继发感染。

    实验材料与方法

    取样方法

    根据患鸟状况及主人的要求,采用人工保定或ISO吸入麻醉后进行采血,选取贵要静脉或右侧颈静脉进行采血操作。抽取0.1ml左右的静脉血,迅速放置在装有EDTA抗凝剂的1.5ml离心管内,-20℃保存。

    DNA提取纯化及PCR检测

    DNA纯化采用Magen公司HIPURE Tissue DNA Kit试剂盒。采用Thermo fisher公司生产的NanoDropND2000检测纯化DNA的浓度及纯度。巢式PCR检测PBFD病毒采用Ypelaar等人的方法[21],第二轮产物回收后产物送睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

    实验结果

    本研究共采集2016-2017年度鹦鹉血液样本157份,来源于26种鹦鹉目鸟类。通过临床检测和问询,可见不同的病例存在多种多样的临床表现,也有没有明显临床症状的个体。其中114个动物有临床症状,其中43.9%(69/157)的病例存在消化系统症状;12.1%(19/157)的病例存在呼吸系统症状,主要表现为呼吸窘迫;18.5%(29/157)的病例存在羽毛/喙/指甲/皮肤异常;。其中3.2%(5/157)同时具有2项症状。仍有24个没有明显临床症状的个体为PBFD阳性。

    由于PBFD临床症状存在多样化,传统诊断方式无法确证。所以本研究引入了BFDV分子临床诊断方法,通过两轮巢式PCR对病例血液提取DNA样品进行扩增,代表性样本两轮PCR的产物都进行琼脂电泳后的结果见图1。A和B泳道为2样本扩增产物,可见该病例为病毒阴性。A泳道为阴性样本的第一轮PCR产物,可见少量的非特异性扩增条带,B为阴性样本的第二轮PCR产物,无359bp阳性条带。C和D泳道为13样本扩增产物,可见该病例为病毒阳性。C为阳性样本的第一轮PCR产物,可见清晰的718bp产物条带,D为阳性样本的第二轮PCR产物,可见清晰的359bp产物条带。

    图1巢式PCR反应后电泳图,M为100bp Plus ladder,A为阴性样品巢式PCR第一轮产物,B为阴性样品巢式PCR第二轮产物,C为阳性样品巢式PCR第一轮产物,D为阳性样品巢式PCR第二轮产物。

    经过对阳性样品第二轮PCR产物回收后进行测序,测序结果在NCBI网站经过BLAST进行DNA序列比对,扩增产物序列与BFDV基因序列一致比对结果见图2。可以完全确定检测方法正确,检测阳性结果是准确可信的。

    图2.阳性样本测序比对结果

    经过对全部157个样本进行DNA提取纯化并进行BFDV巢式PCR检测后,总体检测BFDV的阳性率为 61.1% (96/157)。

    讨论

    由于PBFD在临床上存在多种多样的症状和表现,不存在特异性的临床症状辅助临床医生进行诊断,可能会存在怀疑PBFD病例症状的个体, BFDV检测为阴性,也可能存在不表现临床症状的个体BFDV检测为阳性。因此采用适当的分子生物学检测技术准确的检测PBFD阳性病例,对临床病例的确诊有着重要的意义及必要性。本实验只需微量的血液,通过巢式PCR的方法即可准确、高效、灵敏的检测确诊临床PBFD阳性病例。对于出现的雏鸟突然死亡情况,检测出BFDV阳性也与PBFD特急性表型相符,及时准确的获得诊断结果也能帮助繁育者做好环境消毒、种群隔离及净化工作。

    本实验选取检测的数个病例有其它检测机构之前检测的双病毒检测阴性结果,但所有之前病例送检样本都选用的是拔掉的带有毛囊的羽毛样本。造成这些检测结果为假阴性的原因可能为羽毛样本能提取纯化的DNA浓度偏低及病毒可能在毛囊样本中的滴度偏低有关。这一结论也与Tomasek等2008年得出的实验结果相类似[22],提示在条件允许的前提下应尽量选用血液样本作为分子诊断送检标本。

    本实验结果的BFDV的总体阳性率61.1%(96/157),高于之前台湾的检测结果41.2% (68/165)[23]。同时也高出其它国家的总体检出率(日本31.3 %,德国39.2 %)[24]。这一结果可能与本实验的样本大多来自患病来院就诊有临床症状的病例有关,或者提示大陆的宠物鸟带毒率偏高。综上所述,建议大陆的鸟类繁育及贸易需要做好严格的种群净化及疫病防控工作。

    参考文献

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